Examkin

Question

Difficulty: Very hardProtein Ayrıştırma ve Analiz Teknikleri

Saf olarak elde edilen bir proteinin fizikokimyasal analizleri sonucunda aşağıdaki bulgular saptanmıştır:

- Fizyolojik pH'da (7.47.4) net negatif yüke sahiptir.
- pH 5.05.0 tamponunda katyon değişim kromatografisi kolonuna bağlanmaktadır.
- Denatüre edici koşullarda gerçekleştirilen elektroforez sonuçları şu şekildedir:

Analiz KoşuluGözlenen Bantlar (kDa)
SDS-PAGE (Non-redüktan)50
SDS-PAGE (Redüktan / +β+\beta-merkaptoetanol)50, 25

Bu proteinin yapısal ve biyokimyasal özellikleri dikkate alındığında, aşağıdakilerden hangisi doğrudur?

  1. Proteinin doğal (native) haldeki moleküler ağırlığı 100100 kDa'dır.Answer
  2. B
    Proteinin izoelektrik noktası (pIpI) 5.05.0 değerinin altındadır.
  3. C
    pH 8.08.0 tamponu kullanılarak yapılan anyon değişim kromatografisinde kolona bağlanmadan elüe olur.
  4. D
    Protein, homodimerik yapıda olup alt birimler birbirine yalnızca kovalent olmayan etkileşimlerle tutunmaktadır.
  5. E
    Doğal (native) jel filtrasyon kromatografisinde 5050 kDa ağırlığındaki bir standart protein ile aynı hacimde elüe olur.

Answer

Proteinin doğal (native) haldeki moleküler ağırlığı 100100 kDa'dır.
Verilen verilere göre proteinin pH 7.4'te negatif, pH 5.0'da pozitif yüklü olduğu anlaşılmaktadır (5.0<pI<7.45.0 < pI < 7.4). SDS-PAGE analizinde non-redüktan koşullarda sadece 50 kDa bandı görülürken, redüktan koşullarda hem 50 hem 25 kDa bantlarının görülmesi; 50 kDa'lık bir bandın aslında disülfit bağlarıyla bağlı iki 25 kDa'lık alt birimden oluştuğunu, diğer 50 kDa'lık bandın ise tek bir alt birimi temsil ettiğini gösterir. Bu durumda toplam kütle 50+25+25=10050 + 25 + 25 = 100 kDa olarak hesaplanır.

Step-by-Step Solution

1
İzoelektrik nokta (pIpI) aralığını belirleyin.
5.0<pI<7.45.0 < pI < 7.4
Protein pH 7.4'te negatif yüklü (pI<7.4pI < 7.4), pH 5.0'da ise katyon değişimine bağlandığı için pozitif yüklüdür (pI>5.0pI > 5.0).
2
Non-redüktan SDS-PAGE verilerini yorumlayın.
50 kDa'lık bandın disülfit bağı içeren yapıları ve serbest alt birimleri temsil ettiğini saptayın.
SDS proteinleri denatüre eder ancak disülfit bağlarını kırmaz. 50 kDa bandı hem 50 kDa'lık bağımsız alt birimi hem de disülfit bağlarıyla bağlı 50 kDa'lık kompleksi içerir.
3
Redüktan SDS-PAGE verilerini yorumlayın.
25 kDa bandının disülfit bağı kırılan alt birimlerden geldiğini anlayın.
β\beta-merkaptoetanol disülfit bağlarını indirger. 25 kDa'lık yeni bandın oluşması, non-redüktan haldeki 50 kDa'lık yapının iki adet 25 kDa'lık alt birime ayrıldığını gösterir.
4
Toplam (native) moleküler ağırlığı hesaplayın.
50+(2×25)=10050 + (2 \times 25) = 100 kDa
Yapıda bir adet 50 kDa'lık serbest alt birim ve iki adet birbirine disülfit bağıyla bağlı 25 kDa'lık alt birim bulunmaktadır.

Key Concept

Proteinlerin yapısal analizi; SDS-PAGE'de redüktan/non-redüktan koşulların yorumlanması ve kromatografik verilerle pI tahmini.

Hints

1
Katyon değişim kromatografisine bağlanmak için proteinin net yükünün ne olması gerektiğini hatırlayın.
2
Non-redüktan ve redüktan SDS-PAGE arasındaki fark, sadece disülfit bağlarının varlığına işaret eder.
3
Non-redüktan jelde 50 kDa görünen bant, aslında biri serbest diğeri disülfit bağlı dimer olan iki farklı yapısal elemanın çakışması olabilir mi?

Practice More

İzoelektrik odaklama (IEF) ve SDS-PAGE kombinasyonu olan 2D elektroforez tekniğinin bu protein üzerindeki etkilerini inceleyin.

Alternative Method

Bantların molar oranları verilmemiş olsa da, disülfit bağı içeren bir yapının redüktan koşullarda daha küçük parçalara bölünmesi kuralından yola çıkarak native ağırlık tahmini yapılabilir.
Estimated Time:3m 0s
Rate this question

Topics

Protein Ayrıştırma ve Analiz Teknikleri

More questions from this topic