Bir klinik araştırma laboratuvarında, bir grup hastada belirli bir onkogenin aşırı ifadesini (overexpression) mRNA düzeyinde belirlemek amacıyla Northern Blot yöntemi planlanmaktadır. Ancak laboratuvar uzmanı, DNA fragmantasyonu ve denatürasyonu için Southern Blot protokolünde rutin olarak kullanılan sodyum hidroksit () banyosunun RNA örnekleri için yıkıcı (degredatif) olacağını belirterek bu basamağı protokol dışı bırakmıştır. Northern Blot yönteminde alkali denatürasyonun tercih edilmemesinin temel biyokimyasal nedeni aşağıdakilerden hangisidir?
- RNA molekülündeki grubunun alkali ortamda nükleofilik saldırı başlatarak fosfodiester bağlarını parçalamasıCevap
- BRNA molekülünün bazik ortamda aşırı negatif yüklenerek nitroselüloz membrana bağlanma yeteneğini kaybetmesi
- C'ın RNA yapısındaki urasil bazlarını enzimatik olmayan bir yolla sitozine dönüştürerek hibridizasyon özgüllüğünü bozması
- DAlkali ortamda RNA'nın bazlar arası hidrojen bağlarının kopmak yerine daha kararlı üçlü sarmal (triple helix) yapılar oluşturması
Cevap
RNA molekülündeki 2'-OH grubunun alkali ortamda nükleofilik saldırı başlatarak fosfodiester bağlarını parçalaması
RNA, yapısındaki riboz şekerinin 2' konumunda bulunan serbest hidroksil (-OH) grubu nedeniyle alkali ortama karşı son derece hassastır. Bazik bir ortamda ( iyonları varlığında), bu 2'-OH grubu deprotone olur ve oluşan nükleofil, bitişik fosfodiester bağındaki fosfor atomuna saldırarak 2',3'-siklik monofosfat ara ürünü üzerinden zincirin kırılmasına neden olur. DNA'da (2'-deoksiriboz) bu grup bulunmadığı için Southern Blot sırasında alkali denatürasyon güvenle kullanılabilirken, Northern Blot'ta RNA'nın parçalanmaması için alkali çözeltilerden kaçınılır.
Adım Adım Çözüm
Anahtar Kavram
RNA Alkali Hidrolizi