Moleküler Genetik Teknikler

Orak hücreli anemiye yol açan nokta mutasyonu ($\beta$-globin geninde $6.$ amino asitte gerçekleşen $Glu \rightarrow Val$ değişimi), ilgili DNA dizisindeki $MstII$ restriksiyon enziminin tanıma bölgesini bozmaktadır. Moleküler tanı amacıyla, hastadan alınan DNA örneğinin ilgili bölgesi PCR ile çoğaltılmış ve ardından $MstII$ enzimi ile kesilmiştir (RFLP analizi). Normal allelden köken alan $1.1 kb$ uzunluğundaki PCR ürünü, enzimle kesildiğinde $0.9 kb$ ve $0.2 kb$ büyüklüğünde iki fragman oluşturmaktadır.

Buna göre, heterozigot bir taşıyıcının jel elektroforezi analizi sonucunda aşağıdaki bantlardan hangilerinin gözlenmesi beklenir?

Epigenetik araştırmalarda DNA metilasyon paternlerini belirlemek için kullanılan sodyum bisülfit dizileme yönteminde; saflaştırılmış genomik DNA örneği sodyum bisülfit ile muamele edilir. Bu işlem sonucunda metillenmemiş sitozin ($C$) kalıntıları urasile ($U$) dönüşürken, metillenmiş sitozinler ($5-mC$) kimyasal olarak korunur. İşlem görmüş bu DNA ipliği, daha sonra PCR amplifikasyonu için kalıp (template) olarak kullanılır.

Tamamen metillenmemiş olduğu bilinen $5'-G A C C G T A C-3'$ dizisine sahip bir DNA ipliğine sodyum bisülfit işlemi uygulandıktan hemen sonra (henüz PCR döngüleri başlamadan) oluşan ve kalıp görevi görecek olan ipliğin dizisi aşağıdakilerden hangisidir?

Moleküler biyoloji çalışmalarında, belirli bir doku örneğindeki spesifik bir $mRNA$ dizisinin varlığını ve miktarını (ekspresyon düzeyini) belirlemek amacıyla kullanılan yöntem aşağıdakilerden hangisidir?

Bir klinik araştırma laboratuvarında, bir grup hastada belirli bir onkogenin aşırı ifadesini (overexpression) mRNA düzeyinde belirlemek amacıyla Northern Blot yöntemi planlanmaktadır. Ancak laboratuvar uzmanı, DNA fragmantasyonu ve denatürasyonu için Southern Blot protokolünde rutin olarak kullanılan sodyum hidroksit ($NaOH$) banyosunun RNA örnekleri için yıkıcı (degredatif) olacağını belirterek bu basamağı protokol dışı bırakmıştır. Northern Blot yönteminde alkali denatürasyonun tercih edilmemesinin temel biyokimyasal nedeni aşağıdakilerden hangisidir?

Bir biyoteknoloji şirketinde çalışan araştırmacı, yeni geliştirilen bir ilaç molekülünün meme kanseri hücre hattındaki binlerce genin transkripsiyonel aktivitesi üzerindeki etkisini aynı anda incelemek istemektedir. Araştırmacı, hücrelerdeki tüm genlerin $mRNA$ ekspresyon düzeylerini eş zamanlı olarak profillemeyi hedeflemektedir. Bu amaçla kullanılması en uygun olan moleküler genetik teknik aşağıdakilerden hangisidir?

Bir genetik araştırma projesinde, $X$ kromozomuna bağlı çekinik bir hastalığın taşıyıcısı olan bir kadında $X$ inaktivasyon paternini belirlemek için $Southern$ $Blot$ analizi yapılmaktadır. İncelenen lokusta bir adet $PstI$ (metilasyona duyarsız) ve bir adet $HpaII$ (metilasyona duyarlı; sadece metillenmemiş $5'-CCGG-3'$ dizilerini keser) restriksiyon bölgesi bulunmaktadır. İnaktif $X$ kromozomundaki ilgili bölgenin yoğun metillenmiş olduğu, aktif $X$ kromozomunun ise metillenmemiş olduğu bilinmektedir. Bu kadından alınan genomik $DNA$ örneği önce $PstI$ ile tam kesildikten sonra bir yarısı $HpaII$ ile de muamele ediliyor. Sadece $PstI$ ile kesilen örnekte $6$ $kb$ boyutunda tek bir bant görülürken, $PstI + HpaII$ ile kesilen örnekte hem $6$ $kb$ hem de $4$ $kb$ ve $2$ $kb$ boyutlarında bantların birlikte görülmesi aşağıdakilerden hangisini en iyi açıklar?

Bir genetik tanı merkezinde, bir hastada bilinen bir nokta mutasyonunun (SNP) varlığını araştırmak amacıyla özel bir PCR protokolü tasarlanmıştır. Bu yöntemde kullanılan primerlerden birinin $3'$ ucundaki son nükleotidi, hedef mutasyonun bulunduğu bölgeye tam karşılık gelecek (komplementer olacak) şekilde tasarlanmıştır. Deney sırasında, DNA polimerazın primerin $3'$ ucunda kalıp DNA ile tam bir eşleşme (match) saptadığı durumda zinciri uzatabildiği, ancak tek bir bazlık uyumsuzluk (mismatch) durumunda polimerizasyonu gerçekleştiremediği gözlenmiştir.

Bu çalışma prensibine dayanan ve klinik laboratuvarlarda spesifik mutasyonların hızlı taranmasında kullanılan moleküler teknik aşağıdakilerden hangisidir?

Bir genin belirli bir bölgesindeki tek nükleotid değişikliğinin ($SNP$), o bölgeyi tanıyan bir restriksiyon enziminin kesim bölgesini ortadan kaldırdığı bilinmektedir. Bir bireyde bu spesifik genetik varyasyonun varlığını ve bireyin bu bölge açısından homozigot veya heterozigot olup olmadığını genomik $DNA$ kullanarak belirlemek için en uygun moleküler teknik aşağıdakilerden hangisidir?

DNA dizilemesinde yaygın olarak kullanılan Sanger (zincir sonlanma) yönteminde, sentezlenmekte olan DNA zincirine dahil edildiğinde polimerizasyonun durmasına ve zincirin uzatılamamasına neden olan molekül aşağıdakilerden hangisidir?

Real-Time PCR (kantitatif PCR) analizinde, floresan sinyalinin arka plan gürültüsünü aşarak eşik değerini (threshold) geçtiği döngü sayısı olan eşik döngüsü ($C_t$), başlangıçtaki hedef nükleik asit miktarı ile ters orantılıdır. Bir araştırma projesinde, aynı gen bölgesini hedefleyen iki farklı hücre kültüründen elde edilen DNA örneklerinin analizi sonucunda Örnek 1'in $C_t$ değeri 22, Örnek 2'nin $C_t$ değeri ise 25 olarak saptanmıştır. PCR verimliliğinin her döngüde $\%100$ (tam katlanma) olduğu kabul edildiğinde, bu sonuçlara göre başlangıç hedef DNA miktarları arasındaki ilişki hakkında aşağıdakilerden hangisi doğrudur?

Spinal Müsküler Atrofi (SMA) ve Duchenne Musküler Distrofi (DMD) gibi geniş ekzon delesyonlarının/duplikasyonlarının saptanmasında 'altın standart' kabul edilen MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) tekniği, konvansiyonel Multiplex PCR yönteminin birçok kısıtlılığını (primerler arası rekabet, kantitatif verimlilik farkları vb.) ortadan kaldırmıştır. Buna göre, MLPA yönteminde 50'ye kadar farklı hedef bölgenin tek bir reaksiyonda, primerler arası girişim (interference) olmaksızın ve aynı verimlilikle çoğaltılabilmesini (amplifikasyon) sağlayan temel strateji aşağıdakilerden hangisidir?

Moleküler genetik araştırmalar yapan bir ekip, $5.0$ kilobaz ($kb$) uzunluğundaki dairesel bir DNA molekülünü Southern Blot yöntemiyle haritalandırmaktadır. DNA örneği farklı restriksiyon endonükleazları ile kesildikten sonra elektroforez yapılmış ve dairesel DNA üzerinde tek bir bölgeye spesifik radyoaktif işaretli bir prob ile hibridize edilmiştir. Otoradyografi sonuçları şu şekildedir:

* $EcoRI$ kesimi: $5.0$ kb'lık tek bant
* $BamHI$ kesimi: $3.0$ kb'lık tek bant
* $EcoRI + BamHI$ kesimi: $0.5$ kb'lık tek bant

Bu verilere göre, restriksiyon siteleri ve probun konumu ile ilgili aşağıdaki ifadelerden hangisi doğrudur?

Moleküler biyoloji laboratuvarında çalışan bir biyokimyacı, bir hastadan alınan kas biyopsisi örneğinde distrofin proteininin varlığını ve moleküler ağırlığını değerlendirmek amacıyla Western Blot yöntemini tercih etmiştir.

Bu yöntemle ilgili olarak aşağıda verilen ifadelerden hangisi doğrudur?

Klinik viroloji laboratuvarlarında, bir hastadan alınan tek bir solunum yolu sürüntüsü örneğinde İnfluenza, RSV ve SARS-CoV-2 gibi farklı virüslerin varlığını eş zamanlı olarak araştırmak amacıyla; reaksiyon karışımına her bir hedef gen bölgesi için özgül farklı primer çiftlerinin eklendiği PCR yöntemi aşağıdakilerden hangisidir?

Klinik bir laboratuvarda, $RNA$ genomu taşıyan bir virüsün (örneğin İnfluenza veya $SARS-CoV-2$) tanısını koymak amacıyla moleküler bir test planlanmaktadır. Standart $PCR$ (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) yöntemi doğrudan $DNA$ kalıbı gerektirdiği için, virüse ait $RNA$ moleküllerinin amplifikasyon öncesinde bir $DNA$ kopyasına dönüştürülmesi gerekmektedir.

Bu dönüşüm işlemini gerçekleştiren enzim ve kullanılan moleküler teknik aşağıdakilerin hangisinde doğru olarak verilmiştir?

Bir araştırmacı, şüpheli bir lenfoma vakasında genomik $DNA$'daki belirli bir gen düzenlenmesini (rearrangement) saptamak amacıyla Southern Blotting yöntemini kullanmaya karar verir. İşlem sırasında, elektroforez sonrası ancak $DNA$'nın nitroselüloz membrana transferi öncesinde, jel seyreltik sodyum hidroksit ($NaOH$) içeren alkali bir çözelti ile muamele edilir. Bu aşamada uygulanan alkali muamelenin temel amacı aşağıdakilerden hangisidir?

Bir tıbbi genetik laboratuvarında, belirli bir genin $mRNA$ ekspresyon düzeylerini karşılaştırmak amacıyla "Reverse Transcription-Quantitative PCR" ($RT-qPCR$) yöntemi kullanılmaktadır. Yapılan analizde, Hasta 1 ve Hasta 2'den alınan örneklerin eşik döngü ($C_t$) değerleri sırasıyla $22$ ve $26$ olarak belirlenmiştir.

Reaksiyon verimliliğinin $\%100$ ($E = 2$) olduğu kabul edildiğinde, bu verilere göre hedef $mRNA$ miktarı açısından yapılabilecek en doğru yorum aşağıdakilerden hangisidir?

Moleküler biyolojide 'sentez yoluyla dizileme' (sequencing by synthesis) yöntemlerinden biri olan pirodizileme (pyrosequencing), özellikle kısa DNA dizilerinin hızlı analizinde ve tek nükleotid polimorfizmlerinin (SNP) saptanmasında kullanılan önemli bir tekniktir. Bu yöntemde, kalıp zincire her bir nükleotid bazının eklenmesi sonucunda bir biyolüminesans sinyali elde edilir.

Pirodizileme reaksiyon basamakları ve bu basamaklarda görev alan enzimler ile ilgili aşağıdakilerden hangisi doğrudur?

Sanger (dideoksi) yöntemi ile gerçekleştirilen bir $DNA$ dizi analizinde; $3'-T C G G A T C G C C A T G-5'$ dizisine sahip bir kalıp $DNA$ fragmanı ve bu fragmana komplementer olan $5'-A G C C T-3'$ dizisindeki bir primer kullanılmaktadır. Reaksiyon ortamına dört çeşit $dNTP$ ($dATP, dTTP, dCTP, dGTP$) ve yeterli miktarda $DNA$ polimerazın yanı sıra, sadece $ddGTP$ (dideoksiguanozin trifosfat) eklendiği varsayıldığında; primerden itibaren sentezlenen ve zinciri sonlandırılan fragmanların toplam nükleotid uzunlukları aşağıdakilerden hangisidir?

Moleküler tanı laboratuvarlarında viral yük tespiti için yaygın olarak kullanılan Real-Time PCR (qPCR) sistemlerinden biri olan TaqMan yönteminde, hedef diziye özgü bir oligonükleotid prob kullanılır. Bu probun 5' ucunda bir floresan raportör (reporter), 3' ucunda ise bu raportörün sinyalini baskılayan bir söndürücü (quencher) molekül bulunur. PCR döngülerinin uzama (extension) fazı sırasında raportör molekülün söndürücüden ayrılarak serbest kalması ve saptanabilir bir floresan sinyali vermesi, DNA polimeraz enziminin belirli bir aktivitesi sonucunda gerçekleşir.

Bu analiz yönteminde, probun hidrolize edilerek raportörün serbest kalmasını ve floresan sinyalinin açığa çıkmasını sağlayan temel enzimatik aktivite aşağıdakilerden hangisidir?