Examkin

Soru

Zorluk: ZorMoleküler Genetik Teknikler

Moleküler biyolojide 'sentez yoluyla dizileme' (sequencing by synthesis) yöntemlerinden biri olan pirodizileme (pyrosequencing), özellikle kısa DNA dizilerinin hızlı analizinde ve tek nükleotid polimorfizmlerinin (SNP) saptanmasında kullanılan önemli bir tekniktir. Bu yöntemde, kalıp zincire her bir nükleotid bazının eklenmesi sonucunda bir biyolüminesans sinyali elde edilir.

Pirodizileme reaksiyon basamakları ve bu basamaklarda görev alan enzimler ile ilgili aşağıdakilerden hangisi doğrudur?

  1. A
    Ortama salınan inorganik pirofosfat (PPiPPi), doğrudan lusiferaz enzimi tarafından substrat olarak kullanılarak ışık enerjisine dönüştürülür.
  2. ATP sülfürilez enzimi, adenozin 5'-fosfosülfat (APSAPS) varlığında PPiPPi'yi ATPATP'ye dönüştürerek ışık sinyali için gereken enerjiyi sağlar.Cevap
  3. C
    Apiraz enzimi, reaksiyon ortamındaki DNA polimerazın kalıp zincire bağlanmasını ve polimerizasyon hızını artıran bir yardımcı faktördür.
  4. D
    Işık emisyonu reaksiyonu sırasında lusiferin oksidasyonu için gerekli olan temel indirgeyici güç, hücre dışı ortama salınan NADPHNADPH molekülleridir.
  5. E
    DNA polimerazın nükleotid eklemesi sırasında 3' ucundan ortama doğrudan ATPATP salınması, sinyal üretiminin ana kaynağını oluşturur.

Cevap

ATP sülfürilez enzimi, adenozin 5'-fosfosülfat (APS) varlığında inorganik pirofosfatı (PPi) ATP'ye dönüştürerek lusiferaz reaksiyonu için gerekli olan enerjiyi sağlar.
Pirodizileme tekniğinde anahtar basamak, DNA polimeraz tarafından salınan pirofosfatın (PPiPPi), ATP sülfürilez enzimi ve APSAPS yardımıyla ATPATP'ye dönüştürülmesidir. Bu basamak tamamlanmadan lusiferaz enzimi aktive olamaz ve ışık sinyali oluşamaz.

Adım Adım Çözüm

1
DNA polimerizasyon ürününün belirlenmesi
DNA polimeraz kalıp zincire uygun deoksinükleotid trifosfatı (dNTPdNTP) ekler ve bir molekül inorganik pirofosfat (PPiPPi) açığa çıkar.
Nükleotid katılımı sırasında pirofosfat ayrılması reaksiyonun başlangıç tetikleyicisidir.
2
Enerji dönüşümünün (PPi'den ATP'ye) gerçekleşmesi
Açığa çıkan PPiPPi, ATP sülfürilez enzimi tarafından adenozin 5'-fosfosülfat (APSAPS) kullanılarak ATPATP'ye dönüştürülür.
Lusiferaz enziminin ışık üretebilmesi için yüksek enerjili bir fosfat kaynağı olan ATP gereklidir.
3
Sinyal üretimi
Oluşan ATPATP, lusiferaz enziminin lusiferini oksilusiferine dönüştürdüğü reaksiyonda kullanılır ve orantılı bir ışık sinyali yayılır.
Işık şiddeti, ortama eklenen nükleotid miktarı ile doğrudan ilişkilidir.
4
Ortam temizliği
Apiraz enzimi ortamda kalan fazla dNTPdNTP ve ATPATP'yi yıkar.
Bir sonraki nükleotid eklemesi öncesinde ortamın 'gürültüden' temizlenmesi gerekir.

Anahtar Kavram

Pirodizileme (Pyrosequencing) enzimatik kaskadı

İpuçları

1
Pirodizileme adını, reaksiyonun ilk basamağında açığa çıkan bir molekülden alır.
2
Bu teknikte dört ana enzim görev yapar: DNA polimeraz, ATP sülfürilez, lusiferaz ve apiraz.
3
Işık sinyalini üreten lusiferazın çalışabilmesi için ortamda pirofosfatın önce ATP'ye çevrilmesi şarttır.

Daha Fazla Pratik

Sanger dizileme yöntemi ile pirodizileme yöntemi arasındaki 'terminasyon' ve 'gerçek zamanlı analiz' farklarını gözden geçirin.
Tahmini Süre:2m 0s
Bu soruyu puanla

Konular

Moleküler Genetik Teknikler

Bu konudan daha fazla soru