Spinal Müsküler Atrofi (SMA) ve Duchenne Musküler Distrofi (DMD) gibi geniş ekzon delesyonlarının/duplikasyonlarının saptanmasında 'altın standart' kabul edilen MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) tekniği, konvansiyonel Multiplex PCR yönteminin birçok kısıtlılığını (primerler arası rekabet, kantitatif verimlilik farkları vb.) ortadan kaldırmıştır. Buna göre, MLPA yönteminde 50'ye kadar farklı hedef bölgenin tek bir reaksiyonda, primerler arası girişim (interference) olmaksızın ve aynı verimlilikle çoğaltılabilmesini (amplifikasyon) sağlayan temel strateji aşağıdakilerden hangisidir?
- Tüm farklı hedef problarının, uç kısımlarında aynı evrensel (universal) primer bağlanma dizilerini taşımasıCevap
- BHer bir prob çiftinin birbirinden farklı uzunlukta 'stuffer' (dolgu) dizileri içermesi
- CReaksiyon ortamına PCR verimliliğini artıran pirofosfataz ve helikaz enzimlerinin eklenmesi
- DHer bir ekzon bölgesi için farklı bir dalga boyunda floresan ışık yayan spesifik primerlerin tasarlanması
Cevap
Doğru yanıt, tüm farklı hedeflere ait probların uç kısımlarında aynı evrensel (universal) primer bağlanma dizilerini taşımasıdır.
MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) tekniğinin en kritik stratejisi, amplifikasyonun genomik DNA üzerinden değil, hedef bölgeye bağlanıp birleşmiş (ligasyon) problar üzerinden yapılmasıdır. Tüm probların uçlarında aynı 'evrensel' dizi bulunduğu için, 50 farklı gen bölgesi tek bir primer çiftiyle aynı verimlilikte çoğaltılır. Bu durum, primerler arası fiziksel girişimi ve amplifikasyon verimliliği farklarını (bias) ortadan kaldırarak kantitatif sonuç (ekzon delesyonu veya duplikasyonu) alınmasına olanak tanır.
Adım Adım Çözüm
Anahtar Kavram
MLPA tekniğinde kantitatif başarının temeli, universal primer kullanımıyla amplifikasyon biasının (yanlılığının) önlenmesidir.
Daha Fazla Pratik
Real-time PCR'daki 'Ct' (eşik döngüsü) değerleri ile MLPA kromatogramındaki pik yükseklikleri arasındaki kantitatif ilişkiyi inceleyebilirsiniz.
Tahmini Süre:2m 30s