Examkin

Soru

Zorluk: ZorMoleküler Genetik Teknikler

Moleküler tanı laboratuvarlarında viral yük tespiti için yaygın olarak kullanılan Real-Time PCR (qPCR) sistemlerinden biri olan TaqMan yönteminde, hedef diziye özgü bir oligonükleotid prob kullanılır. Bu probun 5' ucunda bir floresan raportör (reporter), 3' ucunda ise bu raportörün sinyalini baskılayan bir söndürücü (quencher) molekül bulunur. PCR döngülerinin uzama (extension) fazı sırasında raportör molekülün söndürücüden ayrılarak serbest kalması ve saptanabilir bir floresan sinyali vermesi, DNA polimeraz enziminin belirli bir aktivitesi sonucunda gerçekleşir.

Bu analiz yönteminde, probun hidrolize edilerek raportörün serbest kalmasını ve floresan sinyalinin açığa çıkmasını sağlayan temel enzimatik aktivite aşağıdakilerden hangisidir?

  1. 5′→3′5' \rightarrow 3' ekzonükleaz aktivitesiCevap
  2. B
    3′→5′3' \rightarrow 5' ekzonükleaz aktivitesi
  3. C
    RNAse H aktivitesi
  4. D
    DNA ligaz aktivitesi

Cevap

TaqMan probu kullanılarak yapılan qPCR analizinde floresan sinyali, Taq DNA polimerazın sahip olduğu 5′→3′5' \rightarrow 3' ekzonükleaz aktivitesi sayesinde probun hidrolize edilmesiyle açığa çıkar.
Doğru cevap, Taq DNA polimerazın sentez sırasında önüne çıkan engelleri (prob gibi) nükleotid bazında parçalamasını sağlayan 5′→3′5' \rightarrow 3' ekzonükleaz aktivitesidir. Bu parçalanma sonucunda probun uçlarındaki raportör ve söndürücü moleküller birbirinden ayrılır ve floresan sinyali tespit edilir.

Adım Adım Çözüm

1
Probun yapısal analizi
TaqMan probunun 5' ucunda raportör, 3' ucunda söndürücü (quencher) bulunur ve raportörün sinyali söndürücü tarafından baskılanır.
Sinyalin sadece prob parçalandığında saptanabilmesi için raportör ve söndürücünün başlangıçta birbirine yakın olması gerekir.
2
Hibritleşme aşaması
Prob, hedef DNA bölgesine primerler ile birlikte bağlanır.
Spesifik sinyal oluşumu için probun hedef bölgeye tam uyumlu olması şarttır.
3
Uzama ve hidroliz aşaması
Taq polimeraz yeni zinciri sentezlerken proba çarpar ve 5′→3′5' \rightarrow 3' ekzonükleaz aktivitesini kullanarak probu parçalar.
Polimerazın sentez yolunda duran engeli (probu) ortadan kaldırması sırasında prob nükleotidlerine ayrılır.
4
Sinyal tespiti
Serbest kalan raportör molekül söndürücünün etkisinden kurtulur ve floresan ışık yaymaya başlar.
Raportör ve söndürücü arasındaki mesafenin artması, FRET etkisinin sona ermesini sağlar.

Anahtar Kavram

TaqMan qPCR yönteminde sinyal oluşumu, Taq DNA polimerazın sentez sırasında probu parçalayan 5′→3′5' \rightarrow 3' ekzonükleaz aktivitesine dayanır.
Bu soruyu puanla

Konular

Moleküler Genetik Teknikler

Bu konudan daha fazla soru